PhyNexus PTV 92-20-01说明书

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PhyNexus PTV 92-20-01说明书

PhyNexus开发了一种*的技术，用于工程蛋白和抗体的微量纯化，使研究人员能够定期纯化和富集高达1 mL的样品。PhyTip™色谱柱的*设计使洗脱体积低至10μL，从而产生高达50 x的富集因子，纯化蛋白浓度高达5 mg / ml。

纯化和富集的过程是简单的三步技术，其中首先捕获感兴趣的蛋白质，然后纯化并终富集。整个过程可能需要不到15分钟的时间来生成高浓度的全功能蛋白质，可供进一步分析。

• IgG回收率为70-90％
• 获得高度浓缩的纯化蛋白质
• 蛋白质A PhyTip柱显示从不同水平的背景蛋白质中提取具有非常高纯度的IgG蛋白质

蛋白质A PhyTip柱显示出功能性抗体（IgG）的高结合亲和力和高容量亲和纯化。

蛋白A柱采用我们专有的  双流色谱，可  提供完整的抗体结合和高终浓度。PhyTip色谱柱兼容大多数8,12和96通道自动化液体处理机器人，包括  Agilent Technologies，  Beckman Coulter，  Dynamic Devices，  Perkin Elmer，  Hamilton和  Tecan。

具有蛋白A的PhyTip色谱柱已针对特定PhyNexus试剂和仪器流速/体积进行了优化，如下所示。使用PhyNexus纯化系统收集该信息。带有蛋白A的所有PhyTip色谱柱都配有推荐的PhyTip缓冲液，包括：捕获缓冲液 - 用于需要添加额外缓冲液以补充样品体积并确保捕获正确pH值的情况。洗涤缓冲液I - 磷酸盐缓冲溶液pH 7.4洗涤缓冲液II - 盐水溶液。注意：没有缓冲能力以确保有效洗脱富集缓冲液 - 用于终洗脱步骤 - 磷酸盐缓冲溶液pH 2.5中和缓冲液。 - Tris缓冲溶液pH 9.0注意：富集缓冲液以4 mL pH 2.5磷酸盐缓冲溶液的形式提供，

含有蛋白A树脂的200多个PhyTip色谱柱：

对于含有1mg BSA的5μgIgG2a（抗FITC MAb。）的200μL样品，使用下面显示的条件处理，在终样品体积中回收大于40％的原始IgG质量。此外，通过用考马斯检测的SDS-PAGE测定，回收的IgG纯度超过95％。

捕获：通过树脂床以250μL/分钟的流速通过树脂床捕获200μL样品。

纯化：200μLPhyNexus蛋白A洗涤缓冲液I，以500μL/ min的流速通过树脂床两个循环，然后用洗涤缓冲液II进行第二次洗涤，在树脂床上通过流动两个循环速率为500μL/ min。

富集：用10μLPhyNexusProtein A Enrichment Buffer将蛋白质洗脱到溶液中，以500μL/ min的流速通过树脂床5个循环。用3μLPhyNexus蛋白A中和缓冲液中和。

出厂时含有的蛋白G富集缓冲液含有：111mM NaH2PO4,140mM NaCl，14.8mM H3PO4，pH3.0

含有蛋白A树脂的1000多种PhyTip色谱柱：

对于含有5μgBSA的10μgIgG2a（抗FITC MAb。）的500μL样品，使用下面显示的条件处理，在终样品体积中回收大于40％的原始IgG质量。此外，通过用考马斯检测的SDS-PAGE测定，回收的IgG纯度超过95％。

捕获：通过树脂床以250μL/分钟的流速通过四个循环捕获500μL样品。

纯化：1000μLPhyNexusProtein G洗涤缓冲液I，以500μL/ min的流速通过树脂床两个循环，然后用洗涤缓冲液II进行第二次洗涤，以500的流速通过树脂床两个循环。 μL/分钟。

富集：用15mL PhyNexus蛋白A富集缓冲液将蛋白质洗脱到溶液中，以500μL/ min的流速通过树脂床5个循环。用5μLPhyNexus蛋白A中和缓冲液中和。

蛋白质APhyTip®色谱柱的性能特征和分析程序

介绍

PhyNexusPhyTip®色谱柱是创新的纯化工具，可从根本上简化各种来源的蛋白质的捕获，纯化和富集。这些净化工具成功的关键是设计保留亲和树脂床的机制，具有小的死体积和大的捕获潜力。一组PhyTipcolumns包含蛋白A，以在特定适条件下特异性结合来自不同来源的抗体（IgG），从而允许去除核酸和其他污染物。在快速洗涤步骤后，用常用的低pH缓冲液容易地洗脱纯化的抗体。该技术允许特别高产率的IgG，这取决于各种条件，并且在非常高浓度的载体蛋白如BSA的存在下提供高度选择性的纯化。PhyTip色谱柱具有*的结合能力，可以结合超过100μg的IgG，并且可以有效回收少至200 ng的IgG - 代表近三个数量级的范围。PhyTip色谱柱非常适用于从杂交瘤上清液中筛选抗体或用于高通量提取和纯化亲和标记蛋白。

绩效和分析程序

IgG以高亲和力和特异性结合蛋白A. 这种相互作用的强度和选择性使蛋白A能够有效地从复杂的蛋白质混合物中纯化IgG。为了检测PhyTip柱与蛋白A树脂的性能，测量了使用1000+蛋白A PhyTip柱的纯化IgG（抗FITC-MAb）的回收百分比。

材料和方法

样品：10μgmFITC-MAb（IgG2a亚类）在0.5ml 
含有5mg BSA的PBS中，或
2.含有10％FBS（胎牛血清）的DMEM ，或含有5mg BSA的3.SFM 
（无血清培养基）
样品处理：使用以下方案在半自动ME 1000平台上处理所有样品：

1. （1）捕获：通过将样品通过树脂床进行2个输入/输出循环（体积编程为0.6ml，0.25ml / min）来捕获特定蛋白质。
2. （2）纯化：通过用0.5mL PBS（洗涤缓冲液I）进行1个输入/输出循环（体积编程为0.6ml，0.5ml / min）洗涤结合的蛋白质/亲和树脂，然后进行1个输入/输出循环，去除未结合的蛋白质（体积为0.6ml，0.5ml / min），用0.5mL盐水溶液（洗涤缓冲液II）。
3. （3）富集：用15μLpH3.0洗脱缓冲液以4次进/出循环（体积编程为0.1-0.15ml，1ml / min）洗脱IgG2a。洗脱后，加入5μL中和缓冲液。注意，由PhyNexus提供的蛋白A和蛋白G PhyTip柱的当前洗脱缓冲液具有2.5的pH，并且当前的中和缓冲液的pH为9.0。

定量程序

（1）为了制备还原的IgG2a，使15μl终洗脱体积与5μl新制备的TCEP（15μl10mg/ ml TCEP在水中反应，终体积为30μl）反应。

（2）使用HP 1050 HPLC系统将20μl还原的IgG2a注入无孔聚苯乙烯二乙烯基苯反相（C-18）柱中。溶剂A（水中0.1％TFA）和溶剂B（ACN中0.1％TFA）之间的梯度为25％至75％，使用5分钟。检测：214和280nm的UV。

1. （3）T wo主要IgG2a峰在3.18和3.34分钟左右洗脱。在每种情况下，将这两个峰下面积从（3.3-13.5）min积分，并在214nm处记录相应的峰面积。
2. （4）将相同反应条件下的TCEP处理的IgG2a标准品加载到柱中，并用作恢复计算的输入或标准。

IgG2a恢复的结果

在DMEM + 10％FBS中的回收率= 77％SFM中的回收率+ 5mg BSA = 64％。

已知载体蛋白如白蛋白诱导免疫应答并有助于产生良好的抗体，因此当产生抗体时它通常以高量存在。因此，任何纯化和富集程序必须能够耐受高浓度的白蛋白。此外，上面显示的结果似乎表明高背景蛋白浓度（如BSA）的存在可能对回收率有益。

在载体蛋白存在下IgG2a回收率的再现性

为了验证载体蛋白对大IgG2a回收率的作用，并证明重现性，从多个样品（n = 4）中从PBS（以及含有5mg BSA的PBS）中纯化IgG2a。结果表明，在500倍过量的BSA浓度存在下，纯化的IgG2a的回收率提高（至少20％或更多），并且该方法也是高度可重复的。

PBS中的回收率= 42.25％（SD = 4.66％）PBS中的回收率+ 5mg BSA = 66.5％（SD = 7.5％）

选择性表现和分析程序

为了表征和验证蛋白A-IgG亲和相互作用的选择性，将5mg BSA作为载体蛋白添加至0.5μg样品体积（333倍过量）中的15μgIgG。使用Protein A PhyTip柱处理样品。

材料和方法

样品：在0.5ml含有5mg BSA（10mg / ml或1％w / v BSA）的PBS或PBS中的15μgmFITC-MAb（IgG2a亚类）。样品处理：如上文“恢复性能和分析程序”中所述。

IgG定量和纯度分析程序：

（1）将15μl终洗脱体积分成两部分：13μl与新制备的13μl10mg / ml TCEP（终体积=26μl和[TCEP] = 17.5 mM）在室温下反应~16在每个实验中将2μl加载到凝胶上。

（2）使用HP 1050 HPLC系统将20μl以上26μl还原的IgG2a注入无孔聚苯乙烯二乙烯基苯反相（C-18）柱中。溶剂A（水中0.1％TFA）和溶剂B（ACN中0.1％TFA）之间的梯度为25％至75％，使用5分钟。检测：214和280nm的UV。

1. （3）两个主要的IgG2a峰在3.17和3.3分钟左右洗脱。在这两个峰下面积在每种情况下从（3.13-3.5）min积分，并且在214nm处记录相应的mAU。
2. （4）将在相同反应条件下经TCEP处理的IgG2a标准品（注射量为1.08,2.6,4.3,6.48和8.64μgFITC-M Ab）装入柱中并用作恢复计算的标准曲线。

PhyNexus建议使用含有IgG的PhyTip入门试剂盒作为标准，以验证所有应用中PhyTip色谱柱的使用。

用于纯化和富集的样品必须清澈且无颗粒物质。在与PhyTip色谱柱一起使用之前，强烈建议离心样品并仅使用澄清的上清液。

运输和存储

每包PhyTip色谱柱均按照高标准生产和质量控制，并在保留盒中运输，以保持每个PhyTip色谱柱中特定亲和树脂的完整性。本产品在环境温度下运输，但收到后应存放在4到8℃的标准实验室冰箱中。

• 不要冷冻或储存冷冻。
• 不使用时，请将盒盖关闭并密封，存放在冰箱中。
• 在干燥环境中长时间储存​​，不要让亲和树脂干燥。

当从PhyNexus运输时，含有蛋白A的PhyTip柱存储在甘油中。

蛋白质A PhyTip色谱柱可用于这些机器人系统