mdbioproducts常见实验室应用程序的故障排除
洗涤技巧:
确保移液器的每个尖头都正确分配或喷射瓶有足够的压力。清空孔中的内容物并用指示的洗涤缓冲液体积填充孔。倒出孔,倒置并在干净的纸巾上吸干。如插入所示重复此过程。最后一次倾析后,倒置去除任何剩余的洗涤缓冲液,并将其吸干在干净的纸巾上。不要让孔静置,按照插图中的指示进行下一步。注意:如果在倾析时条带变得松散,则在清洗和在干净的水槽中滗析之前对条带进行编号非常有用。
确保有适当的真空供应。检查所有插管或插脚是否正确分配和抽吸。通过抽吸或倾析清空孔。将每个孔填充到插入物中指示的适当体积。*吸出孔。去除缓冲液后,让抽吸装置留在孔中,不要过度抽吸孔。如插入物所示重复此过程,不要让孔在最后一次抽吸后保持干燥。
移液技术:
确保您使用的移液器已校准,并且移液器吸头正确且牢固地固定在移液器上。将移液器设置到所需的体积并用样品或试剂预冲洗。缓慢向上吸取试剂,使移液器缓慢返回向上位置。稍等片刻,让试剂在吸头中达到体积平衡。将试剂缓慢分配到第一次停止,然后轻轻分配到第二次停止。将移液器保持在此位置,直到将其从储液器或孔中取出,以避免将试剂吸回。当您取下移液器时,将吸头向上拉到容器或孔的一侧,以释放可能在吸头外侧的任何液体。
ELISA 故障排除
许多因素会影响 ELISA 的性能。
IHC 故障排除
无染色
问题 | 可能的解决方案) | |
一抗和二抗可能不匹配。 | 建议二抗针对产生一抗的物种(例如,如果一抗是在小鼠中产生的,则使用抗小鼠二抗)。 | |
该抗体可能不适用于以天然(非变性)形式显示蛋白质的 IHC 程序。 | 在非变性和变性蛋白质印迹上测试抗体,以确保抗体识别非变性抗原。 | |
二抗未避光保存。 | 建议避免将二抗暴露在光线下。 | |
没有足够的一抗与目标蛋白质结合。 | 减少抗体稀释。 在 4°C 下孵育更长时间。 | |
感兴趣的蛋白质并不大量存在于组织中。 | 运行阳性对照。 利用放大步骤可以帮助放大信号。 使用较低稀释度的一抗。 | |
目标蛋白是核蛋白,抗体不能穿透细胞核。 | 为了促进细胞核的渗透,在封闭缓冲液和抗体稀释缓冲液中加入透化剂。 | |
脱蜡可能不够 | 将切片脱蜡时间更长。 使用新鲜制备的二甲苯。 | |
福尔马林和多聚甲醛等固定剂可能会改变抗体识别的表位。 | 使用抗原修复方法揭露表位。 修复时间更短。 | |
PBS 缓冲液可能被细菌污染,这些细菌已经破坏了目标蛋白质。 | 在 PBS 抗体储存缓冲液中使用防腐剂,如 0.01% 叠氮化物。 使用新鲜的无菌 PBS。 |
高背景
问题 | 可能的解决方案) | |
非特异性结合的阻断可能是不够的。 | 将切片的封闭潜伏期延长至 30 分钟,将细胞培养延长至 1 小时。使用封闭剂,例如 10% 正常血清用于切片,1-5% BSA 用于细胞培养。 | |
一抗浓度可能太高。 | 将抗体滴定至更佳浓度,使用更多稀释液孵育更长时间。这将提供更慢但更具体的绑定。 | |
二抗可能非特异性结合。 | 在没有一抗的情况下运行二级对照。 | |
孵化温度可能太高。 | 在 4°C 下孵育组织切片或细胞。 | |
组织未充分洗涤。 | 在所有步骤之间用 PBS *清洗 | |
内源性过氧化物酶是有活性的。 | 使用酶抑制剂,如碱性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或过氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。 | |
福尔马林和多聚甲醛等固定剂太强,可能已经改变了抗体识别的表位。 | 改变抗原修复方法。 减少抗原暴露溶液的孵育时间。 | |
应用了过多的基材。 | 减少底物孵育时间。 | |
色原与细胞中存在的 PBS 发生反应。 | 在与底物一起孵育之前,使用 Tris 缓冲液清洗切片。 | |
透化已经损坏了膜并去除了膜蛋白。 | 从缓冲液中去除通透剂。 |
非特异性染色
问题 | 可能的解决方案) | |
一抗或二抗的浓度可能太高。尝试降低抗体浓度和/或潜伏期。 | 将信号强度与不表达目标的细胞进行比较。 | |
一抗是针对与染色组织相同的物种产生的(例如在大鼠组织上测试的大鼠一抗)。 | 当应用二抗时,它会与所有组织结合,因为它也是针对该物种产生的。使用针对与您的组织不同的物种产生的一抗/二抗。 | |
内源性过氧化物酶是有活性的。 | 使用酶抑制剂,如碱性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或过氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。 | |
切片/细胞已变干。 | 将组织切片和细胞保持在高湿度下,不要让它们变干。 |
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