BACPAC——FISH克隆基因DNA产物

BACPAC

链接：https://bacpacresources.org/

BACPAC基因组学是由初在纽约州布法罗市Roswell Park癌症研究所（2000年以前）和美国加利福尼亚州奥克兰市CHORI的学术实验室创建BAC（和PAC）库的科学家们于2000年至2020年间创建的。包含了由BAC、PAC或Fosmid克隆组成的可用基因组DNA文库、一些cDNA文库、文库筛选试剂（高密度克隆杂交过滤器）以及BAC、PAC和Fosmid克隆载体的信息。自2019年9月1日起，BACPAC资源不再在奥克兰儿童医院研究所运营，所有订单均由一家小型公司“BACPAC Genomics"处理，该公司初位于加利福尼亚州Richmond。

通过BAC修饰（BAC modification/recombineering），我们可以将报告基因放置在BAC特定的调控序列之后，也可以将点突变引入目的基因、或是将BAC上的片段转移到质粒载体上以及在BAC骨架上添加筛选标记等。

服务说明

为您购买BAC

如果您知道您需要的BAC的ID号，请提供给我们，我们将为您购买。如果对使用的BAC有疑惑，我们也可以根据您研究的基因为您找到合适的BAC。绝大多数BAC可从CHORI 的BACPAC资源中心获取，但某些BAC需要从其他供应商购买。您也可以直接给我们寄送含有BAC的大肠杆菌。

“一步法BAC修饰"

既可用于引入大片段如在某个基因的启动子后面加上用于示踪的报告基因（图1），也可引入小改变，如点突变（图2）。

大片段的引入（图1）：片段包含有目的基因（GOI）（例如LacZ或GFP报告基因）、两侧为FRT位点的药物筛选表达框，其两端具有与重组区域同源的同源臂。通过同源重组来替代BAC上的内源区域，药物筛选表达盒可用于鉴定成功修饰的BAC克隆，可通过Flp介导的重组删除该表达盒，只留下一个FRT位点。

图1. “一步法BAC修饰"示意图：在启动子后面引入目的基因（GOI）(如LacZ或GFP报告基因)

引入点突变（图2）：片段包含突变区域、两侧为FRT位点的药物筛选表达框，其两端具有与重组区域同源的同源臂。通过同源重组取代BAC上的内源区域，最后通过Flp介导的重组删除该表达盒，只留下一个FRT位点。FRT位点被认为是“瘢痕"序列，因为修饰后的BAC除了所需的点突变之外，还携带这个残留的FRT。为了不影响基因功能，该瘢痕序列要放置在基因的非功能区域，如内含子或UTR区。

图2. “一步法BAC修饰"示意图：在基因的第一外显子中引入点突变并将FRT序列放置在下游内含子中

“两步法BAC修饰"

“两步法BAC修饰"用于将微小的变化（如点突变）引入BAC，而不留下FRT瘢痕序列（图3）。该方法适用于以下情况，即在预期突变位点的附近，没有合适的空间放置残留的FRT瘢痕序列。例如，如果要修饰的基因是非常大的单外显子基因，并且所需的突变位点位于基因的中间，则在点突变附近没有合适的位置来放置瘢痕序列。在这种情况下，应该使用两步法，该方法利用表达药物筛选标记的基因片段进行阳性和阴性筛选（图3）。第一步，使用该基因片段进行同源重组来替代内源靶区域，通过药物阳性筛选获得成功重组的BAC；第二步，通过同源重组，使用包含突变位点的片段替代药物筛选基因片段，利用阴性选择筛出实现点突变的BAC。

图3. “两步法BAC修饰"示意图：在大的单个外显子基因中引入点突变而不留下瘢痕序列

将筛选标记添加到BAC骨架上

使用该类BAC转染到细胞时，BAC骨架上的筛选标记将有利于其在细胞中被筛选或示踪，这将有利于通过药物筛选分离含有稳定整合BAC的细胞。

将BAC上的片段转移到质粒载体上

我们可以将BAC的任何区域（可达60 kb）转移到质粒载体上单独进行研究。例如，如果利用整个BAC构建转基因小鼠以研究在BAC上某个基因的功能，同一BAC上的其他基因可能会对研究结果有影响，而将目的基因单独分离到质粒上并使用该质粒构建转基因小鼠可以避免这个问题。另外，在技术层面，使用质粒比使用BAC更加简单。

BAC修饰的鉴定

BAC修饰区域将通过测序鉴定。由于重复序列的存在，BAC可能会发生片段缺失。为了降低这种可能性，我们将重新转化修饰后的BAC，并挑选获得单克隆，通过在整个BAC上进行多个位点的PCR扩增来确认其没有发生大片段缺失。

BACPAC常卖产品